2. BIOLOGIA

2.1 Genetica

Il melanoma familiare

Circa il 10% dei pazienti con melanoma citano almeno un altro membro della propria famiglia come affetto da melanoma (1). La natura familiare del melanoma non oculare è stata osservata per primo da Cawley nel 1952 (2). La presenza di forme ereditarie di melanoma ha suggerito una base genetica e il primo modello ereditario, realizzato tramite analisi di segregazione, ha consentito di formulare un meccanismo autosomico dominante con penetranza variabile (1). Nel 1978, Clark (3) descrisse, in famiglie con melanoma, un precursore ("B-K mole"), successivamente rinominato "nevo displatico". Anche l'inserimento della sindrome del nevo displastico (DNS) nell'analisi genetica delle famiglie evidenziò un meccanismo autosomico dominante come base dell'eziologia del melanoma familiare. Questi studi suggerirono anche che DNS e melanoma, in tali famiglie, rappresentavano effetti pleiotropici di un singolo gene (4-5). La relazione tra DNS e melanoma familiare non è tuttavia del tutto chiarita per le seguenti cause: a) presenza di melanoma familiare in famiglie prive di DNS; b) presenza di nevi displastici in forma sporadica in proporzioni variabili (tra il 5 e il 53% dei casi a seconda degli studi) in individui non appartenenti a famiglie con predisposizione ereditaria al melanoma (1) (vedi anche paragrafo: eterogeneità genetica del melanoma familiare).

Alterazioni di geni oncosoppressori nel melanoma familiare

Cannon-Albright, Skolnik e collaboratori (6) all'inizio degli anni '90, con studi di linkage, identificarono la regione cromosomica 9p13-p22 come sede di un locus, situato tra i marcatori D9S126 e IFN-á che controlla la predisposizione al melanoma familiare e probabilmente contenente un gene oncosoppressore. L'identificazione del gene oncosoppressore in 9p è avvenuta grazie allo sviluppo della strategia di analisi genetica nota come "positional cloning" modificata per la ricerca di delezioni omozigoti in cellule neoplastiche. Questa complessa procedura ha permesso di isolare un frammento di DNA (tecnicamente si trattava di un cosmide) che conteneva due sequenze correlate definite MTS1 e MTS2 (7). Una di queste conteneva gli esoni di un gene precedentemente identificato. Il gene (a cui sono stati attribuiti vari nomi, incluso p16, MTS1, INK4A, CDKN2, CDKN2A) contribuisce a codificare due distinte proteine p16 e p19ARF. In realtà, sebbene i geni per p16 e p19ARF mappino nella stessa zona cromosomica, le proteine p19ARF e p16 hanno in comune solo l'esone 2.

La funzione del gene p16

La proteina p16 è stata scoperta nel 1993 (8-9) in cellule trasformate, come un complesso che comprendeva PCNA (proliferating cell nuclear antigen), ciclina D e la chinasi ciclina-dipendente CDK4. Successivamente si è chiarito che p16 è una subunità regolatrice negativa di CDK4 e di CDK6. CDK4 e CDK6 controllano la progressione attraverso la fase G1 del ciclo cellulare (10) (Figura 1). Le cicline D sono co-fattori delle chinasi CDK4 e 6, e la funzione di CDK4 e CDK6 è quella di fosforilare la proteina del gene del retinoblastoma (Rb). Una delle funzioni della proteina codificata da RB e' quella di formare complessi con fattori di trascrizione che risultano in tal modo inibiti funzionalmente. La fosforilazione di Rb determina il distacco dei fattori di trascrizione ad esso legati. I fattori di trascrizione rilasciati a loro volta consentono l'espressione di geni necessari alla progressione attraverso G1. La funzione di p16 come inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti lo configura come un gene oncosoppressore in quanto in sua mancanza viene meno un controllo negativo sulla proliferazione cellulare. Delezioni di p16 sono state trovate in un'alta percentuale di molti tumori umani di diversa origine istologica, incluso il melanoma, indicando un possibile ruolo generale di alterazioni di p16 nella trasformazione neoplastica di diversi tessuti (11).

Ruolo di p16 nel melanoma familiare

Nel 1994 Hussussian e collaboratori (12), in un gruppo di famiglie con melanoma con linkage a marcatori della regione cromosomica 9p21, identificarono, tramite analisi SSCP ("single strand conformational polymorphism"), sei diverse mutazioni di p16 nella linea germinale in 9 su 15 famiglie. Le mutazioni erano del tipo "missense", "nonsense", "frameshift" ed anche mutazioni dei siti di "splicing". Tali mutazioni vennero trovate solo in famiglie con melanoma in linkage con marcatori della regione cromosomica 9p21 e non in famiglie con melanoma in linkage con marcatori alla regione 1p36 (vedi paragrafo successivo). In 33/36 casi di melanoma delle famiglie "9p21", il gene p16 risultava alterato fornendo una forte evidenza di associazione con lo sviluppo della neoplasia. Per contro solo 10 su 33 casi di DNS presentavano mutazioni di p16, a conferma dei dubbi circa il meccanismo unico e comune di ereditarietà di DNS e melanoma (12). In molti casi le proteine mutate di p16 sono state saggiate funzionalmente ed hanno rivelato difetti di legame a CDK (in-vitro) e di difetti di inibizione della proliferazione (in-vivo). Studi successivi (condotti su famiglie negli Stati Uniti, Inghilterra, Francia, Israele, Svezia, Australia, Austria, Italia etc..) hanno indicato l'esistenza di un ampio spettro di mutazioni a carico di diverse zone codificanti del gene p16. Tali mutazioni potevano essere distinte sia per la localizzazione (in termini di esoni e codoni coinvolti) sia per il tipo di sostituzione di base, sia per le conseguenze funzionali sull'espressione e funzione genica. Più recentemente, l'analisi per la presenza di mutazioni a carico di p16 nella linea germinale è stata estesa a pazienti che presentavano melanomi primitivi multipli, ma che appartenevano a famiglie prive di predisposizione ereditaria alla malattia (cioè famiglie senza altri membri affetti). L'insorgenza di melanomi primitivi multipli ha suggerito una suscettibilità genetica che è stata confermata in questi pazienti ed in altri membri delle loro famiglie dalla presenza di mutazioni di p16 nella linea germinale (13).

Il ciclo cellulare è diviso in quattro fasi (Fig. 1). Dopo la divisione cellulare si ha una fase (G1) seguita da sintesi di DNA (S), da una seconda fase (G2) e da una successiva mitosi (M). Tutte le fasi del ciclo, e le transizioni da una fase alla successiva sono regolate dall'azione di enzimi (chinasi) costituite da una subunità regolatrice e da una subunità catalitica. Le cicline sono subunità regolatorie che si legano a subunità catalitiche (CDK) per formare complessi ciclina-CDK enzimaticamente attivi. Le cicline durante il ciclo subiscono fasi di sintesi e degradazione, predisponendo un meccanismo di regolazione delle CDK. L'attività delle CDK è inoltre regolata da piccole proteine (tra cui p15, p16, p21, p27) chiamate inibitori di CDK. Questi piccoli inibitori si legano ai complessi ciclina-CDK. I complessi attivi ciclina-CDK guidano la cellula attraverso momenti particolari del ciclo cellulare, chiamati "checkpoints" che consentono alla cellula di procedere da una fase all'altra del ciclo. L'attività enzimatica dei complessi ciclina-CDK consente di fosforilare gruppi di proteine che sono essenziali per la transizione da una fase all'altra del ciclo.

Eterogeneità genetica nel melanoma familiare

Studi di vari gruppi, successivi al lavoro di Hussussian (discussi anche in ref. 14), hanno indicato che mutazioni di p16 si ritrovano in proporzioni variabili di famiglie con membri affetti da melanoma. Infatti dal 20% fino a >60% delle famiglie studiate presenta mutazioni di p16 che co-segregano con il me -lanoma. La proporzione di famiglie con mutazioni nella linea germinale a carico di p16, tra le famiglie con melanoma ereditario, varia molto nei diversi studi a seconda del numero di individui affetti e del background etnico. Di conseguenza anche il melanoma familiare è eterogeneo nelle sue cause genetiche. Ad esempio, ci sono famiglie con forte evidenza di linkage a marcatori localizzati nella regione 9p21 ma che mancano di mutazioni a carico di p16 (14). Ciò ha suggerito la presenza di un secondo gene oncosoppressore, diverso da p16, nella stessa regione cromosomica 9p21. Sebbene la zona contenga il gene MTS2 (o p15), che come p16 funziona da inibitore di CDK, nessuna mutazione germ-line di p15 è stata trovata. È anche possibile che alcuni geni p16 apparentemente normali abbiano in realtà mutazioni non in zone codificanti (esoni), ma in zone regolatrici (a monte del promotore) ancora non esplorate. Dati recenti (15) indicano che questa possibilità è reale. Infatti in alcune famiglie che dimostrano linkage del melanoma ereditario a marcatori della regione cromosomica 9p21, ma che non presentano mutazioni nella regione codificante di p16, è stata trovata una mutazione a monte del promotore del gene. Tale mutazione crea un nuovo codone di inizio (AUG) e determina una riduzione della trascrizione genica dal promotore normale del gene. Ulteriori dati indicano che in alcune famiglie il meccanismo di suscettibilità genetica al melanoma è basato non sulla delezione, ma sull'attivazione nella linea germinale di un gene diverso da p16. Anche questo gene contribuisce, come p16, a regolare il ciclo cellulare. Infatti, in alcune famiglie sono state trovate mutazioni nella linea germinale a carico del gene CDK4 (16). La mutazione a carico di CDK4 altera la sequenza della proteina a livello del sito di interazione con p16. In entrambi i casi (mutazioni a carico di CDK4 o di p16) la capacità di chinasi come CDK4 di fosforilare Rb viene scissa da un controllo negativo. Ciò può predisporre un meccanismo che favorisce la continua proliferazione cellulare. Inoltre, mentre p16 si comporta come gene oncosoppressore, CDK4 funziona come oncogene (16). CDK4 da questo punto di vista è il terzo oncogene implicato nella predisposizione ereditaria al cancro (gli altri sono RET e MET). Le mutazioni di CDK4 quindi funzionano in modo dominante, mentre le alterazioni di p16 hanno un meccanismo recessivo, in quanto, in quest'ultimo caso, per svelare l'effetto sulla trasformazione neoplastica è necessaria la presenza di una lesione genetica a carico del primo allele nella linea germinale e la successiva delezione o inattivazione dell'allele normale nella linea somatica.

Ulteriore eterogeneità genetica alla base del melanoma familiare deriva dall'evidenza, in parte discussa, per un locus per il melanoma ereditario mappato con studi di linkage nella regione cromosomica 1p36 (17). Nello studio di Bale (17) il gruppo di famiglie era caratterizzato da melanoma familiare e da DNS, fatto che ha suggerito un meccanismo comune per l'eredità di DNS e melanoma in tali casi. Questo dato è in contrasto con le famiglie che mostrano un linkage con 9p21, nelle quali DNS è stato trovato solo in 10/33 casi che presentavano mutazione di p16 (12). Questi dati confermano non solo l'eterogeneità genetica del melanoma familiare, ma anche la relazione complessa tra DNS e melanoma.

2.2 Immunologia

Linfociti T tumore-specifici infiltrano il tumore primitivo e/o le lesioni metastatiche

Il modello di progressione tumorale per il melanoma primitivo in stadio I e in fase di crescita verticale (VGP), proposto da W. Clark nel 1989 (18), attribuiva un valore di fattore prognostico indipendente alla presenza di linfociti infiltranti la neoplasia (TIL, "tumor infiltrating lymphocytes"). Questo dato suggeriva un possibile coinvolgimento del sistema immunitario nel controllo della progressione tumorale.

Gli studi iniziati da Clark e Elder e proseguiti da Clemente, Mihm e Cascinelli (19) hanno dimostrato che la lesione primitiva può presentare, in relazione all'infiltrato, tre situazioni diverse, definite come "brisk", "non-brisk" o "absent". I risultati nel melanoma primitivo con componente di crescita verticale (quindi un melanoma che ha acquisito la competenza per la metastasi) avevano indicato che questa classificazione ha un valore prognostico in quanto la sopravvivenza a 5 e 10 anni era nettamente migliore nel sottogruppo di pazienti con infiltrato di tipo brisk rispetto ai pazienti con infiltrato di tipo non-brisk e la differenza era ancora più marcata nel paragone tra sottogruppo brisk e sottogruppo absent (18). Quest'analisi è stata recentemente ripetuta su metastasi linfonodali (19). Nel caso di metastasi linfonodali di melanoma la crescita del tumore è stata paragonata alla fase di crescita verticale della neoplasia primitiva e all'interno della massa proliferante si è studiata la presenza di TIL. I risultati hanno dimostrato che i tre gruppi di pazienti con infiltrato classificato come brisk, non-brisk o absent hanno sopravvivenze (valutate a 30 mesi) distinte con un netto vantaggio a favore del gruppo con infiltrato di tipo brisk. Questi risultati suggeriscono che anche a livello di lesioni metastatiche, la presenza di un infiltrato linfocitario (e quindi, indirettamente, la presenza di una risposta immunitaria) possa costituire un parametro importante per predire l'evoluzione della malattia.

Riconoscimento del melanoma da parte di linfociti T isolati dal sangue periferico o dalla lesione neoplastica

In accordo con i dati derivanti dallo studio dell'infiltrato linfocitario, studi condotti a partire dall'inizio degli anni '80 avevano indicato che linfociti T isolati dal sangue periferico (PBL, "peripheral blood lymphocytes") o dal tessuto neoplastico (TIL) di pazienti con melanoma primitivo o metastatico potevano, dopo attivazione in-vitro, riconoscere in modo specifico il tumore autologo e determinarne la lisi cellulo-mediata (20). La procedura sperimentale (MLTC, mixed lymphocyte-tumor culture) consisteva nella co-cultura a lungo termine di linfociti T e cellule neoplastiche irradiate in presenza di interleuchina-2, come fattore di crescita per i linfociti T. Queste osservazioni iniziali implicavano l'esistenza di antigeni tumorali sul melanoma umano e il loro riconoscimento da parte del sistema immunitario del paziente.

Ulteriori studi condotti con tecniche molecolari hanno permesso di verificare che, in una frazione dei pazienti, i linfociti T tumore-specifici che infiltrano o il tumore primitivo o le lesioni metastatiche costituiscono in realtà espansioni clonali di pochi o anche di un solo clone T (21). Ciò ha indicato che la lesione neoplastica può essere sede di proliferazione di cloni di linfociti T antigenespecifici. Tale proliferazione è apparentemente guidata dall'espressione di antigeni tumorali sulle cellule neoplastiche.

Il melanoma umano esprime antigeni tumorali riconosciuti da linfociti T autologhi

A partire dall'inizio degli anni '90, ad opera degli studi pionieristici di T. Boon, è stato possibile identificare una serie di geni espressi nel melanoma umano e che codificano per antigeni tumorali riconosciuti da linfociti T sia a fenotipo CD8 che CD4 (22). Gli antigeni tumorali sono peptidi derivati dalla degradazione intra-cellulare di proteine. Tali peptidi si associano, sulla superficie della cellula neoplastica, ad alleli del maggior complesso di istocompatibilità (HLA). Il complesso HLA-peptide viene riconosciuto da un recettore per l'antigene (TCR) espresso in modo clonale da linfociti T. Durante gli anni '90 sono stati identificati molti antigeni tumorali del melanoma umano. Frequentemente l'antigene tumorale deriva dall'espressione in cellule neoplastiche di un gene normale, privo di alterazioni. Tali geni normali possono essere sia tessuto-specifici (cioè con espressione limitata a melanociti normali e a cellule di melanoma) o essere espressi prevalentemente in diversi tessuti neoplastici ma non nella controparte normale. In tutti questi casi il peptide antigenico viene prodotto con il meccanismo di degradazione intracellulare a partire dalla proteina normale. Il numero di peptidi antigenici già individuati in queste categorie geniche è proporzionale alla dimensione della proteina. È inoltre prevedibile che il numero di peptidi antigenici corrispondenti a proteine di notevole dimensione sia destinato a crescere rispetto alle conoscenze attuali. Antigeni tumorali del melanoma possono essere generati anche con altri meccanismi che si basano su alterazioni strutturali dei geni (es. mutazioni puntiformi). In questi casi il peptide antigenico conterrà la sostituzione aminoacidica, corrispondente alla mutazione, all'interno della propria sequenza. Questo è il caso di antigeni come CDK4, MUM-1 e ß-catenina. La generazione di antigeni tumorali del melanoma può dipendere anche da altri meccanismi dovuti ad alterata regolazione dell'espressione genica nelle cellule neoplastiche: esempi sono rappresentati da traduzione di mRNA eseguita utilizzando "open reading frames" alternative (come nel caso del gene TRP-1), "splicing" incompleto, traduzione di sequenze introniche (come nel caso del gene TRP-2), trascrizione da un promoter criptico situato all'interno di un introne (Gn-TV), sostituzione post-traduzionale di un aminoacido (uno dei peptidi antigenici di tirosinasi viene prodotto con questo meccanismo). È dunque evidente che all'interno della cellula neoplastica avvengono modificazioni nella regolazione dell'espressione genica capaci di produrre antigeni tumorali con meccanismi distinti dal "semplice" processamento di una sequenza proteica (normale o mutata) risultante dalla traduzione dei soli esoni.

La maggior parte dei peptidi antigenici identificati nel melanoma umano si associano ad alleli HLA di classe I (alleli ai loci HLA-A,-B e -C) e determinano la formazione di epitopi riconosciuti da linfociti T a fenotipo CD8, in genere a funzione citolitica (22). Dati recentissimi indicano comunque che anche linfociti a fenotipo CD4, di tipo helper, possono riconoscere, in associazione a molecole HLA di classe II (es. alleli ai loci HLA-DR, -DP e -DQ), peptidi derivanti dal processamento e degradazione intracellulari di proteine espresse nel melanoma (23). Mentre linfociti CD8+ sono considerati effettori finali della risposta immunitaria, i linfociti CD4+ sono determinanti per l'inizio, l'espansione e il mantenimento della risposta immune. È quindi fondamentale che antigeni tumorali riconosciuti da entrambi i principali subsets di linfociti T vengano identificati e utilizzati come bersagli di approcci di immunizzazione.

Queste scoperte consentono di ipotizzare nuovi sviluppi terapeutici nel settore dell'immunoterapia antigene-specifica che siano applicabili ad una frazione cospicua dei pazienti. Questa possibilità teorica deriva sia dalla molteplicità degli antigeni già individuati, sia dal numero di diversi alleli HLA che sono già stati caratterizzati come elementi di restrizione per antigeni tumorali. Tutti questi approcci terapeutici dipenderanno dalla disponibilità di antigeni tumorali in varia forma. È possibile infatti prevedere l'uso di peptidi sintetici, di geni, di proteine ricombinanti, di lisati di cellule neoplastiche, e di cellule neoplastiche modificate geneticamente per esprimere molecole e fattori immunostimolatori. L'efficacia dei tentativi di potenziare la risposta immunitaria contro antigeni del melanoma non dipenderà solo dalla forma antigenica, ma anche da molti altri fattori. Ad esempio, l'espressione antigenica e di molecole HLA sulle cellule neoplastiche del paziente costituirà un elemento chiave per il riconoscimento immunitario. Inoltre le modalità di somministrazione del vaccino (dosi, vie di inoculo, uso di adiuvanti, impiego di citochine immuno-regolatorie e di cellule professionali per la presentazione dell'antigene come le cellule dendritiche, etc..) potranno influire in modo determinante sulla capacità effettiva di indurre una risposta immune contro l'antigene oggetto del vaccino.

Studi clinici iniziali di vaccinazione (con peptidi sintetici o con lisati di cellule neoplastiche presentati al sistema immunitario da cellule dendritiche) indicano che e' possibile attivare in-vivo, in pazienti con melanoma metastatico, una risposta immune antigene-specifica contro antigeni del melanoma (24-25). A ciò corrisponde anche, in alcuni casi, evidenza di regressione di lesioni neoplastiche pre-esistenti.

Il melanoma umano può eludere e/o sopprimere la risposta immunitaria

Il primo problema è quello dei meccanismi di elusione della risposta immunitaria da parte del melanoma umano ed è esemplificato dalla nota eterogeneità intra-tumorale per l'espressione sia dei determinanti antigenici sia delle molecole HLA (26). Ciò si realizza sia per assenza di espressione genica in alcune cellule neoplastiche, sia per la comparsa di mutazioni a carico dei geni che codificano per alleli HLA o per proteine coinvolte nel trasporto intra-cellulare dei peptidi (geni TAP). Questi meccanismi possono di fatto abolire l'espressione di antigeni tumorali o dei complessi HLA-peptide antigenico e vanificare la risposta immune T-mediata.

Il melanoma umano può anche attuare una serie di meccanismi immunosoppressivi. Ad esempio cellule neoplastiche possono produrre fattori solubili come TGF-ß , IL-10, e VEGF (27-29). I meccanismi immunosoppressivi mediati da questi fattori sono distinti: IL-10 può bloccare il differenziamento del subset TH1 (linfociti CD4 "helper", determinanti per lo sviluppo della risposta immune cellulo-mediata). VEGF può inibire la maturazione di cellule dendritiche (cellule deputate alla presentazione di antigeni e all'attivazione dei linfociti anti-tumore). Inoltre, linfociti T isolati da pazienti sono frequentemente caratterizzati da difetti di attivazione, indotti da cellule neoplastiche, e che conducono al blocco della risposta immunitaria (30). Infine, il melanoma umano, soprattutto in fase metastatica, esprime e rilascia in forma solubile molecole di adesione (come ICAM-1) (31, 32). Queste molecole quando sono in forma ancorata alla membrana giocano un ruolo fondamentale nel consentire il legame tra cellule del sistema immunitario e cellule neoplastiche. Tuttavia, in forma solubile, le stesse molecole di adesione occupano i recettori sui linfociti T e di fatto ne impediscono l'interazione con il tumore.

Le prospettive per uno sviluppo clinico dell'immunoterapia del melanoma dipenderanno in modo determinante dalla capacità di comprendere e contrastare i principali meccanismi di elusione e soppressione della risposta immunitaria ad opera delle cellule neoplastiche.

Valutazione della "eleggibilità biologica" a studi clinici di terapia immunologica con "vaccini"

Nel corso degli ultimi anni, lo sviluppo delle conoscenze sulla immunobiologia del melanoma cutaneo, e sul ruolo della risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata dell'ospite nell'interazione con le cellule neoplastiche, ha permesso l'applicazione clinica (in presenza di lesioni parametro o in fase adiuvante) di nuove e più sofisticate applicazioni di terapia immunologica con "vaccini terapeutici" cellulari e/o proteici (33). Tuttavia, la loro applicazione clinica non può prescindere dalla caratterizzazione fenotipica del tumore del singolo paziente, adoperando differenti metodiche di analisi (es. immunoistochimica, citofluorimetria a flusso, analisi degli acidi nucleici), o dalla disponibilità di quantitativi adeguati di tessuto neoplastico per generare "vaccini" autologhi. Pertanto, sono utili alcune considerazioni pratiche sulle metodologie che, in aggiunta alla diagnosi istologica, possono aiutare la pratica clinica permettendo la valutazione della "eleggibilità biologica" di pazienti affetti da melanoma in differente stadio clinico di malattia, al trattamento con "vaccini" diversi.

Al momento, queste considerazioni trovano applicazione prevalentemente nel melanoma metastatico, ma possono essere estese quantomeno al melanoma primitivo ad alto rischio di recidiva, per il quale iniziano ad essere disponibili trattamenti immunologici in fase adiuvante:

1. Criopreservazione di tessuto neoplastico: la disponibilità di tessuto neoplastico, congelato a -80°C, permette l'esecuzione di indagini immunoistochimiche con anticorpi monoclonali (mAb) non reattivi con il tessuto fissato (es. analisi dell'espressione di antigeni che rappresentano il "target" terapeutico, antigeni HLA di classe I ed alleli di "restrizione" per peptidi immunogenici), nonché l'estrazione di acidi nucleici (RNA) per l'analisi dell'espressione di antigeni melanoma-associati mediante RT-PCR. È importante sottolineare che, in molte occasioni, la mancanza di tessuto neoplastico criopreservato non permette di valutare "la eleggibilità biologica", e quindi di candidare a trattamenti di immunoterapia un numero rilevante di pazienti affetti da melanoma, riducendo pertanto lo spettro di possibilità terapeutiche potenzialmente applicabili nel singolo soggetto.
   Indicazioni terapeutiche:
   a) immunoterapia con peptidi immunogenici di antigeni tumorali melanoma-associati o di differenziazione melanocitaria (MAGE, MART-1, gp100, ti-rosinasi, etc.);
   b) immunoterapia passiva con mAb diretti contro antigeni "target" espressi sul tessuto neoplastico;
   c) immunoterapia attiva specifica con mAb anti-idiotipo;
   d) preparazione di "vaccini" autologhi (Heat Shock Proteins, cellule APC pulsate con lisato tumorale, etc.).
2. Criopreservazione di cellule neoplastiche: ottenute per disgregazione meccanica e/o enzimatica di tessuto tumorale fresco e criopreservate in condizioni vitali. Possono essere adoperate in parziale alternativa al tessuto neoplastico (vedi punto 1), e anche per indagini quantitative dell'espressione di antigeni di membrana e/o intracitoplasmatici (citofluorimetria a flusso, ELISA, etc.).
   Indicazioni terapeutiche:
   a) vedi punto 1;
   b) creazione di vaccini tumorali autologhi geneticamente modificati.
3. Estrazione e criopreservazione di acidi nucleici: permette l'esecuzione di indagini molecolari (es. PCR, RT-PCR, Northern e Southern blotting) per l'analisi dell'espressione nel tessuto neoplastico di antigeni melanomaassociati e di differenziazione melanocitaria.
   Indicazioni terapeutiche:
   a) vedi punto 1 e 2.
4. Purificazione e criopreservazione di linfociti: linfociti purificati da sangue periferico e criopreservati in condizioni vitali, possono essere adoperati per definire funzionalmente la presenza di linfociti circolanti antigene-specifici (es. limiting diluition assay, citometria a flusso, enzyme-linked immunospot, tetrameri di complessi HLA-peptide) (34), per la tipizzazione sierologica degli antigeni HLA di classe I del paziente affetto da melanoma, come tessuto non patologico autologo di controllo in test che analizzano il tessuto neoplastico del paziente.
   Indicazioni terapeutiche:
   a) vedi punto 1 e 2.
5. Criopreservazione del siero autologo: la disponibilità di siero autologo da sangue periferico permette l'analisi della presenza e la quantizzazione di diversi fattori solubili (es. ICAM-1, S100, differenti citochine) che sembrano rivestire significato prognostico nel melanoma, nonché di anticorpi circolanti diretti contro le cellule neoplastiche.
   Indicazioni terapeutiche:
   a) vedi punto 1 e 2.
   

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