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Basi Scientifiche per LINEE GUIDA:
- Melanoma Cutaneo
- Testa e Collo
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- Tumori Rari

ATTIVITA' DELLA DIREZIONE

Coordinatore: prof.ssa Rosella SILVESTRINI

Unità Operative associate: Paolo G. CASALI
Alessandro GRONCHI
Marco A. PIEROTTI

La Direzione del Progetto Strategico di Oncologia Bridge ha svolto diverse attività.

  1. Coordinamento scientifico delle Unità Operative (49) afferenti al Progetto
  2. Formulazione di "Basi Scientifiche per la definizione di Linee Guida in ambito clinico per patologie oncologiche"
  3. Controlli di Qualità e sviluppo di protocolli sperimentali, per la diagnosi molecolare dei carcinomi della mammella e dell'ovaio familiari

1. Coordinamento scientifico

Il monitoraggio dell'attività scientifica è stato condotto attraverso contatti diretti con i responsabili di sottoprogetti e con le singole U.O.. La Direzione inoltre ha promosso l'interazione tra le Unità Operative all'interno di ciascun Sottoprogetto e tra le Unità Operative afferenti ai diversi Sottoprogetti, in occasione di un interessante e proficuo incontro svoltosi a Rimini l'8-10 maggio 2002.

A conclusione del Progetto, la Direzione ha proceduto alla revisione delle relazioni scientifiche dell'attività svolta nell'ambito dei singoli Sottoprogetti ed a curare la versione finale della relazione e alla compilazione degli allegati, con particolare riferimento all'elenco dei lavori pubblicati su riviste internazionali con Impact Factor riportanti la sponsorizzazione del CNR e dei protocolli clinici in prosecuzione dal Progetto Finalizzato ACRO o attivati nell'ambito di questo Progetto Strategico.

2. Formulazione di "Basi Scientifiche per la definizione di Linee Guida in ambito clinico per patologie oncologiche"

Nell'ambito delle sue attività, la Direzione ha proseguito il suo impegno per l'estensione delle Basi Scientifiche per la Definizione di Linee Guida in Ambito Clinico per patologie oncologiche, con la produzione di due importanti documenti, fortemente attesi dalla comunità scientifica. Il primo documento è stato quello relativo alla formulazione delle Basi scientifiche per la definizione di Linee Guida in ambito clinico per i Sarcomi dei tessuti molli dell'Adulto (U.O. Gronchi). Nelle malattie rare il riferimento dei pazienti a centri iperspecialistici è abbastanza inevitabile e, in generale, rappresenta un modo semplice ed efficace per garantire una buona qualità di cura. Le linee guida per i Sarcomi dei tessuti molli dell'Adulto non possono sostituire l'expertise iperspecialistico necessario ad una buona qualità di cura in una patologia rara e complessa quali sono i Sarcomi; tuttavia questo documento costituisce un terreno comune per un certo grado di collaborazione interistituzionale, tra centri iperspecialistici ed alcuni centri specialistici dislocati nel Paese. Il documento contiene una parte testuale, con supporto bibliografico e indicazione almeno qualitativa dell'evidenza a sostegno delle raccomandazioni cliniche ed una parte grafica, sotto forma di algoritmi, che consentono l'incorporazione delle linee guida anche in strumenti informatizzati per la gestione dei pazienti. . Il percorso, che ha portato alla produzione di questo documento, ha seguito diverse tappe; prima fra tutte è stata l'acquisizione di un consenso sui principali aspetti problematici dello stato dell'arte del trattamento dei sarcomi dei tessuti molli dell'adulto, da parte dei rappresentanti dei Gruppi collaborativi europei per la ricerca clinica sui sarcomi. Nel febbraio 2001 è stato organizzato a Milano, a cura dell'Istituto Nazionale Tumori, un Forum di consenso, a cui hanno partecipato i rappresentanti dell'Italian Sarcoma Group, del Soft Tissue and Bone Sarcoma Group dell'EORTC, dello Scandinavian Sarcoma Group, del French Sarcoma Group, dello Spanish Group for Research on Sarcomas. Il Forum ha consentito di verificare un buon consenso sostanziale, anche sui punti potenzialmente più controversi, pur a fronte di prassi cliniche abbastanza dissimili in Europa riguardo ad alcuni aspetti. Sulla base dei risultati di questa iniziativa e del capitolo "Soft Tissue Sarcomas" di START ("State-of-the-Art Oncology in Europe") della European School of Oncology, è stata discussa una proposta di consenso per l'Italia ,nell'ambito di un secondo incontro tenutosi a Milano nel maggio 2001 presso l'Istituto Nazionale Tumori, a cui hanno preso parte i rappresentanti delle principali istituzioni italiane coinvolte nel trattamento dei sarcomi. A livello italiano si è registrata una notevole convergenza, in termini di principio e di fatto,fra le istituzioni con maggiore esperienza sui sarcomi. Attraverso il sito Web dell'Istituto Nazionale Tumori di Milano,si è proceduto all'apertura di un forum di discussione, via Web, sulle conclusioni provvisorie del Gruppo di lavoro. E' stata elaborata una proposta finale di consenso ,che, a partire dal febbraio 2002, è stata posta on-line attraverso il nuovo portale "E-Oncology" degli IRCCS oncologici.Nel corso del mese di maggio,è stata realizzata la stampa del documento e l'inserimento on-line in un sito Web liberamente accessibile, con facoltà degli utenti di inviare commenti ai Coordinatori. E' stato previsto che il documento finale venga aggiornato almeno annualmente, oltre che nell'eventualità di modificazioni dello stato dell'arte. Salvo necessità ulteriori, si prevede un primo aggiornamento sistematico a partire da maggio 2003.

Il secondo documento promosso dalla Direzione del Progetto Strategico di Oncologia Bridge mirato all'estensione delle Basi Scientifiche per la Definizione di Linee Guida in Ambito Clinico per patologie oncologiche, è stato quello relativo alla formulazione delle Basi metodologiche per la definizione di Linee Guida in ambito clinico nei tumori rari (U.O. Casali), il quale si diversifica in maniera sostanziale dagli altri analoghi, finalizzati alla trattazione di singole e specifiche neoplasie. Questa diversificazione è dovuta al fatto che i tumori rari comprendono una eterogeneità di patologie e che a tutt'oggi esistono notevoli problematiche, dalla loro precisa definizione, alle incertezze nella decisione clinica, con le inevitabili implicazioni di carattere etico.

Per l'elaborazione del documento, è stato costituito un gruppo di studio, con attivazione di una mailing list riservata in posta elettronica e allestimento di un sito Web "privato". Dopo un seminario introduttivo alla statistica bayesiana e dopo una iniziale fase di discussione on-line, via posta elettronica, si è tenuto a Bologna il 15-16 gennaio 2001, un incontro al quale erano presenti dieci clinici, nove statistici/epidemiologi, due informatici, un oncologo sperimentale, tutti partecipanti al gruppo di studio. L'incontro ha consentito di discutere lo stato attuale della metodologia della ricerca nei tumori rari, i fondamenti concettuali e le potenzialità applicative degli approcci bayesiani, le possibili applicazioni di tecnologie innovative per l'estrazione automatica della conoscenza attraverso data base distribuiti in rete, gli spazi per un affinamento metodologico della fase della decisione clinica in condizioni di incertezza, i possibili progetti per la ricerca clinica e traslazionale, secondo modalità innovative nel campo dei tumori rari. Soprattutto, è risultato evidente che il problema della definizione di linee guida, o comunque di raccomandazioni, per la pratica clinica nei tumori rari si interseca con il problema della ricerca clinica. Essenzialmente, l'elevato grado di incertezza sussistente nel campo della decisione clinica sui tumori rari discende dalla ricerca clinica. Questa incertezza potrebbe però trovare diverse forme di compensazione, da ricercarsi sul terreno della metodologia della decisione clinica. Le linee guida sui tumori rari dovrebbero da un lato tenere conto dell'incertezza ed accettarla come inevitabile proprio per la maggiore rarità di queste patologie e dall'altro dovrebbero comportare regole decisionali in grado di compensare questa incertezza, anche attraverso un adeguato coinvolgimento del paziente. La riflessione su queste conclusioni dell'incontro di Bologna ha richiesto più tempo del previsto, anche per l'ovvia complessità delle implicazioni. Nel corso del mese di maggio, nell'ambito di una riunione ristretta, è stato redatto un primo documento conclusivo, sottoposto per più ampio consenso nell'estate 2002. La pubblicazione del documento finale è stata realizzata nell'ottobre 2002.

3. Controlli di Qualità e sviluppo di protocolli sperimentali per la diagnosi molecolare dei carcinomi della mammella e dell'ovaio familiari

L'obiettivo di questo progetto (U.O. Pierotti) è stato quello di verificare l'efficacia di protocolli di laboratorio, basati sull'impiego combinato della denaturing high pressure liquid cromatography (DHPLC) con il protein truncation test (PTT) o il saggio multiple-dye cleavase fragment length polymorphism (MD-CFLP), nello screening molecolare del gene BRCA1 nella popolazione italiana e valutare la sensibilità di tali tecniche in confronto con altri metodi di analisi mutazionale. Nella sua formulazione iniziale il programma di ricerca prevedeva di analizzare la sensibilità della tecnica denominata DHPLC nell'identificare la presenza di mutazioni nei geni BRCA1 e BRCA2, associati alla predisposizione ereditaria al carcinoma della mammella e dell'ovaia. In considerazione del fatto che il finanziamento effettivamente erogato è risultato inferiore alla richiesta iniziale, il piano sperimentale è stato modificato e l'analisi è stata limitata al solo gene BRCA1. Tale parziale ridimensionamento del progetto è stato in parte compensato dall'inclusione nello stesso della verifica della sensibilità, sempre limitatamente al solo gene BRCA1, di altri due metodi di screening mutazionale: il Protein Truncation Test (PTT) ed il Multiple-Dye Cleavase Fragment Length Polymorphism (MD-CFLP).

Lo studio è stato condotto su un totale di 80 soggetti con evidenza di suscettibilità ereditaria al carcinoma mammario e/o ovarico, riferiti consecutivamente tra l'ottobre 1999 ed il settembre 2000 dal Servizio di Genetica Medica dell'Istituto Nazionale Tumori (INT) di Milano. I DNA costitutivi di questi soggetti sono stati purificati da prelievi di sangue periferico ed analizzati con le seguenti metodiche:

a) sequenziamento diretto dell'intera regione codificante;
b) DHPLC per tutti gli esoni eccetto l'11;
c) PTT limitatamente al solo esone 11, che codifica circa il 60% dell'intero prodotto genico.

Un sottogruppo di 21 casi è stato inoltre inviato al laboratorio del dr. Daniele Calistri (Istituto Oncologico Romagnolo, Forlì) per essere analizzato per la presenza di mutazioni nell'esone 11 di BRCA1 mediante la tecnica denominata MD-CFLP, messa a punto dal dr. Calistri stesso.

Le alterazioni identificate sono state classificate come segue:

· mutazioni patogenetiche (PAT), comprendenti: a) le inserzioni, le delezioni nucleotidiche e le sostituzioni di base, che introducevano segnali precoci di terminazione della traduzione proteica (frameshift, nonsense); b) le sostituzioni nucleotidiche, che modificavano il senso della traduzione proteica rispetto alla forma wild-type (missense), se in grado di alterare la conformazione di importanti domini funzionali della proteina; c) le sostituzioni nucleotidiche ,che modificavano i siti di riconoscimento per lo splicing dell'mRNA;
· varianti genetiche a significato incerto (VG), comprendenti le mutazioni missense ed introniche situate a non più di 20 basi dalla estremità degli esoni, non classificate come polimorfismi nel database del Breast Information Core (BIC, http://www.nhgri.nih.gov/Intramural_research/Lab_transfer/Bic/index.html);
· polimorfismi, comprendenti a) le mutazioni missense ed introniche classificate come tali nel database del BIC, sulla base della frequenza osservata nella popolazione;b) le sostituzioni nucleotidiche silenti; c) le sostituzioni introniche localizzate a pù di 20 basi dalle estremità degli esoni.

I risultati ottenuti con i diversi approcci sono stati comparati tra loro, allo scopo di valutare la sensibilità relativa delle diverse metodiche considerate.

Non considerando i polimorfismi, il sequenziamento diretto ha identificato un totale di 27 varianti nucleotidiche (20 PAT e 7 VG) nel campione considerato. I risultati ottenuti con le altre metodiche sono riassunti in Tabella 1.

Tabella 1. Confronto di sensibilità di differenti tecniche di analisi di mutazione

Metodo
no. casi analizzati
esoni analizzati
no. mutazioni identificate sul totale accertato mediante sequenziamento
     
PAT
VG
TOT
DHPLC
80
tutti eccetto 11
6/6 (100%)
3/3 (100%)
9/9 (100%)
PTT
80
11
13/14 (93%)
0/4
13/18 (72%)
MD-CFLP
21
11
8/8 (100%)
0/2
8/10 (80%)
DHPLC+PTT
80
tutti
19/20 (95%)
3/7 (43%)
22/27 (81%)
DHPLC+MD-CFLP
21
tutti
14/14 (100%)
3/5 (60%)
17/19 (89%)

L'analisi mediante DHPLC ha identificato tutte le mutazioni (n=9) individuate mediante sequenziamento negli esoni analizzati con questa metodica.

L'analisi mediante PTT ha individuato il 93% (13/14) delle mutazioni PAT presenti nell'esone 11. Per le sue caratteristiche intrinseche, questa metodica è in grado di rilevare la presenza solo delle muatzioni che introducono un segnale precoce di terminazione della traduzione proteina (frameshift e nonsense) e non è quindi applicabile all'analisi delle mutazioni VG.

Escludendo le varianti dovute alla presenza di polimorfismi genetici, l'analisi mediante MD-CFLP ha evidenziato la presenza di profili elettroforetici alterati rispetto ad un campione di controllo, in dodici casi e segnatamente in otto dei dieci casi effettivamente mutati e in quattro degli undici senza mutazione (sensibilità: 80%; specificità; 63%). Le due mutazioni non identificate sono risultate essere le uniche due varianti missense presenti nel gruppo dei casi mutati.

Nell'analisi dell'intera regione codificante di BRCA1, l'uso combinato delle metodiche considerate ha dimostrato le seguenti sensibilità: DHPLC+PTT: 95% per le mutazioni PAT, 43% per le VG e 81% per i due tipi di mutazioni considerati congiuntamente; MD-CFLP+PTT: 100%, 60%, 89%, rispettivamente.

Il presente studio, seppure condotto su un numero limitato di campioni, ha confermato che la tecnica DHLPC ha una sensibilità del 100% nell'identificare alterazioni nucleotidiche nel gene BRCA1, in accordo con quanto già precedentemente riportato e può pertanto rappresentare nell'analisi mutazionale una valida alternativa al sequenziamento diretto, rispetto al quale permette un risparmio dei costi valutabile nell'ordine del 70%.

Un ulteriore risparmio sui costi dell'analisi può essere realizzato utilizzando tecniche che consentano di ridurre il numero di saggi singoli nello screening di esoni codificanti di grosse dimensioni. E' questo il caso dell'esone 11 di BRCA1, che si estende per una lunghezza totale di circa 3.5 kb e per il quale l'analisi mediante PTT e MD-CFLP richiede l'esecuzione di due o tre saggi singoli rispettivamente, contro i 14 richiesti dall'analisi in DHPLC.

I risultati ottenuti dimostrano che l'uso di protocolli che utilizzano la DHLPC in combinazione con PTT o MD-CFLP, oltre ad essere conveniente dal punto di vista economico, è in grado di identificare mutazioni a sicuro significato patogenetico nel gene BRCA1 con elevata sensibilità e può quindi essere applicato ai fini diagnostici.

 

 
ultimo aggiornamento 10.07.03